ABSTRACT Introduction. Research based on medicinal plants is one of the recommended strategies for the search for new therapeutic alternatives against leishmaniasis. In this study, the potential of products derived from Bixa orellana L. on Leishmania amazonensis, a causal agent of cutaneous leishmaniasis (CL), is demonstrated. Methods. Bixa seed products (extracts, fractions, sub-fractions and essential oil) were obtained, which were evaluated in different in vitro and in vivo biological models. Results. The hydroalcoholic extract caused inhibition of the growth of promastigotes and amastigotes, was able to control the development of experimental CL in BALB/c mice (100 mg/kg/day/15 days/intraperitoneal), and its chemical profile was obtained. Subsequently, a bioguided study was performed with 4 fractions and 28 sub-fractions, which BO-B1 and BO-B3 were promising and a group of aliphatic isomers (bixin and norbicin) were identified. The essential oil was the other product obtained, which was chemically characterized, inhibited the growth of amastigotes, showed a cytotoxicity seven times lower with respect to the activity on the parasite, was effective against the experimental CL (30 mg/kg/day/15 days/intraperitoneal and intralesional) and a specific inhibition of oxygen consumption and mitochondrial complex II was evidenced. The essential oil formulated in nanocochleates showed high efficacy in the murine model when 4 doses were administered intralesionally. The results of this research demonstrate the potential of B. orellana seeds on L. amazonensis for the treatment of CL, a disease with various clinical presentations that currently has limited therapeutic options.

RESUMEN Introducción . La investigación basada en plantas medicinales es una de las estrategias recomendadas para la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas contra la leishmaniasis. En este estudio, se demuestran las potencialidades de productos derivados de Bixa orellana L. sobre Leishmania amazonensis, agente causal de la leishmaniasis cutánea (LC). Métodos. Se obtuvieron los productos de las semillas de Bixa (extractos, fracciones, subfracciones y aceite esencial), los cuales fueron evaluados en diferentes modelos biológicos in vitro e in vivo. Resultados. El extracto hidroalcohólico causó inhibición del crecimiento de promastigotes y amastigotes, fue capaz de controlar el desarrollo de la LC experimental en ratones BALB/c (100 mg/kg/día/15 días/intraperitoneal), y se obtuvo su perfil químico. Posteriormente, se realizó un estudio bioguiado con 4 fracciones y 28 sub-fracciones, de las cuales BO-B1 y BO-B3 resultaron promisorias y se identificaron un grupo de isómeros alifáticos (bixina y la norbicina). El aceite esencial fue el otro producto obtenido, el cual fue caracterizado químicamente, inhibió el crecimiento de amastigotes, mostró una citotoxicidad 7 veces menor respecto a la actividad sobre el parásito, fue efectivo contra la LC experimental (30 mg/kg/día/15 días/intraperitoneal e intralesional) y se evidenció una inhibición de manera específica del consumo de oxígeno y el complejo II mitocondrial. El aceite esencial formulado en nanococleatos demostró una alta eficacia en el modelo murino al administrar 4 dosis por vía intralesional. Los resultados de esta investigación demuestran las potencialidades de las semillas de B. orellana sobre L. amazonensis para el tratamiento de la LC, enfermedad con diversas presentaciones clínicas que cuenta actualmente con limitadas opciones terapéuticas.

ABSTRACT Introduction: Within the Trypanosomatidae family, there are two genera of medical importance for their role as human pathogens, Trypanosoma and Leishmania. Within these genera are species and subspecies that cause leishmaniasis, American Trypanosomiasis and Human African Trypanosomiasis. Objective. In this study, we investigated the phylogenetic relationships of the genus Leishmania and Trypanosoma using the cytoplasmic hsp70 gene and we discussed the implications for species definitions, evolution and taxonomy of these genera. Methods: The hsp70 gene from 44 strains from 11 Leishmania species and 41 strains from 9 Trypanosoma species from different geographical origins were sequenced. The sequences obtained were aligned with the sequences previously published in the databases. The MEGA program was used for the construction of different phylogenetic trees based on distance and character parameters. The support of the monophyletic groups was determined by the "boostrap" method. Results: For the first time, the cytoplasmic hsp70 gene was used in phylogenetic studies of the Leishmania and Trypanosoma genus and, with the results obtained, it was demonstrated that it is convenient to use it as a molecular marker for molecular methods design for detection, identification and differentiation of Leishmania and Trypanosoma species and lineages. Evidence is provided that supports the hypothesis that the genus Leishmania originated in South America (“New World”), thus contributing to the general discussion about the origin of this genus. Conclusion: This study actively contributed to discussing the implications of this analysis for the taxonomic framework for the Leishmania and Trypanosoma genera.

RESUMEN Introducción: Dentro de la familia Trypanosomatidae hay dos géneros de importancia médica por su papel como patógenos humanos, Trypanosoma y Leishmania. Dentro de estos géneros se encuentran especies y subespecies causantes de la leishmaniasis, la tripanosomiasis americana y la tripanosomiasis africana humana. Objetivos: En este estudio investigamos las relaciones filogenéticas de los géneros Leishmania y Trypanosoma utilizando la secuencia del gen hsp70 citoplasmática y discutimos las implicaciones para las definiciones de especies, la evolución y la taxonomía de estos géneros. Métodos: Se secuenció el gen de la HSP70 de 44 cepas de 11 especies de Leishmania y 41 cepas de 9 especies de Trypanosoma de diferentes orígenes geográficos. Las secuencias obtenidas se alinearon con las secuencias publicadas previamente en las bases de datos. El programa MEGA se utilizó para la construcción de distintos árboles filogenéticos basados en parámetros de distancia y caracteres. El soporte de los grupos monofiléticos se determinó por el método de boostrap. Resultados: En el presente trabajo se utilizó por primera vez el gen de la hps70 citoplasmática para estudios filogenéticos de los géneros Leishmania y Trypanosoma y con ello se demostró la utilidad de utilizarlo como marcador molecular en el diseño de métodos para la detección, identificación y diferenciación de especies y linajes de Leishmania y Trypanosoma. Los resultados proporcionan evidencias que soportan la hipótesis de que el género Leishmania es originario del “nuevo mundo”. Conclusiones: Los resultados de los estudios, basados en el análisis filogenético del gen que codifica las hps70, contribuyeron a la discusión sobre de un marco general de consenso taxonómico para los géneros Leishmania y Trypanosoma.

ABSTRACT We studied the fungal endophyte community of the leaves of Myracrodruon urundeuva in Brazil along with their potential to produce L-asparaginase. In total, 187 endophytes were isolated. The colonization rate of leaf fragments from caatinga (10.41 %) was lower than those from brejo de altitude (39.58 %). Sequences of ITS rDNA from all endophytes revealed relationships with Ascomycota (Botryosphaeriales, Chaetothyriales, Diaporthales, Eurotiales, Glomerellales, Hypocreales, and Pleosporales) and Basidiomycota (Polyporales). The most frequent endophytes were members of the genus Diaporthe. Talaromyces was an indicator genus for caatinga while Phyllosticta, Diaporthe, and Colletotrichum were for brejo de altitude. The composition of endophytic fungi in caatinga and brejo de altitude differed significantly, its richness and diversity (H' = 3.41) being significantly higher in brejo de altitude. Diaporthe sp. URM 7793 was the best producer of L-asparaginase (2.41 U/g), followed by Diaporthe sp. URM 7779 (2.00 U/g), Talaromyces sp. URM 7785 (1.91 U/g), and Diaporthe sp. URM 7792 (1.47 U/g). The composition of endophytic fungi assemblages is strongly influenced by the type of ecosystem. In its natural habitat, M. urundeuva harbors an important diversity of endophytes, which could be used to produce L-asparaginase.

Introducción. La leishmaniasis es una enfermedad de gran prevalencia en Colombia, donde al menos seis especies diferentes la originan en el ser humano, con un amplio rango de características clínicas. La tipificación de la especie es importante, no solo desde el punto de vista epidemiológico, sino para el diagnóstico, dado que el tratamiento puede variar dependiendo de la especie identificada. En la identificación se han utilizado varias alternativas metodológicas con diferentes niveles de poder discriminatorio. Objetivo. Identificar especies de Leishmania mediante la amplificación molecular de un fragmento del gen hsp 70. Materiales y métodos. Se amplificó un fragmento del gen hsp 70 mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR- hsp 70) y se hizo el análisis de los polimorfismos de la longitud ( Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) de los fragmentos de restricción de 81 aislamientos clínicos de Leishmania spp. de pacientes con leishmaniasis cutánea y mucocutánea para la identificación de las especies presentes. Resultados. Se obtuvo un solo amplicón para todas las muestras analizadas. La restricción enzimática de los 81 productos permitió la identificación de 70 con dos patrones de bandas que correspondían a dos alelos de Leishmania braziliensis (62 y ocho aislamientos, respectivamente), nueve aislamientos compatibles con L. panamensis y dos con L. guyanensis . El origen geográfico de los aislamientos coincidió con el de reportes previos sobre la distribución de dichas especies en Colombia. Conclusiones. La técnica de la PCR- hsp 70 y el análisis de RFLP fueron útiles para identificar las especies de Leishmania aisladas de muestras clínicas de Colombia y pueden aplicarse también en el estudio de cepas de vectores y reservorios de importancia epidemiológica.

Introduction: Leishmaniasis is highly prevalent in Colombia, where at least six different species can cause disease of varying clinical presentations in humans. The identification of the infecting species is quite important for prognosis, therapeutics and epidemiology. Different techniques with variable discriminatory power have been used for the identification. Objective: To carry out the molecular identification of Leishmania species through the amplification of a fragment of the hsp 70 gene. Materials and methods: Molecular amplification of the hsp 70 gene fragment (PCR- hsp 70) followed by restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP) was done for identification purposes using DNA from 81 clinical isolates of Leishmania . Results: A single amplicon was obtained for all samples analyzed. The enzymatic restrictions of the 81 PCR products identified 70 with a banding pattern corresponding to L. braziliensis with two different patterns (62 and eight isolates, respectively), nine isolates compatible with L. panamensis and two with L. guyanensis . The geographical origin of the isolates is consistent with previous reports about the distribution of the corresponding species in Colombia. Conclusions: The PCR- hsp 70/RFLP technique used is a valid tool for the identification of Leishmania species isolated from clinical samples of patients in Colombia, which may also be applicable to the study of strains obtained from vectors and reservoirs with epidemiological significance.

Objectives. Explore a new target for molecular diagnosis of Leishmania. Materials and methods. We evaluated the utility of the gene that encodes the heat shock protein 20-kDa (Hsp20) for detecting Leishmania by polymerase chain reaction (PCR). PCR was normalized and analytical parameters were determined, as well as the validity and diagnostic accuracy, and concordance with the PCR - 18S. PCR-Hsp20 with DNA was obtained from a group of clinical samples from different sources. Results. The analytical parameters were adequate. The sensitivity obtained was 86% and the specificity was 100%. The concordance with the reference method was good (κ = 0.731), which supports its potential use for diagnosis. The possibility of subsequent identification of the species by sequencing the amplified product gives an additional advantage. Conclusions. The usefulness of this gene as a new target for the detection of Leishmania was demonstrated. Because of its potential, it is recommended to improve the sensitivity of the method and to evaluate it in different endemic regions.

Objetivos. Explorar una nueva diana para el diagnóstico molecular de Leishmania. Materiales y métodos. Se evaluó la utilidad del gen que codifica la proteína de choque térmico de 20kDa (hsp20) para la detección de Leishmania por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).Se normalizó la PCR y se determinaron los parámetros analíticos, así como la validez y seguridad diagnóstica y la concordancia con la PCR-18S. Se evaluó la PCR-hsp20 con ADN obtenido de un grupo de muestras clínicas de distinta procedencia. Resultados. Los parámetros analíticos resultaron adecuados. La sensibilidad obtenida fue de 86% y la especificidad del 100%, la concordancia con el método de referencia resultó buena (κ = 0,731), lo que apoya su posible uso para el diagnóstico. La posibilidad de identificación posterior de la especie mediante secuenciación del producto amplificado le confiere una ventaja adicional. Conclusiones. Se demuestra la utilidad de este gen como una nueva diana para la detección del género Leishmania. Debido a su potencial, se recomienda mejorar la sensibilidad del procedimiento y realizar su evaluación en diversas regiones endémicas.

INTRODUCTION: leishmaniosis has been regarded by the World Health Organization as one of the most important tropical diseases. It is very difficult to control such parasitosis because there are not vaccines, and therapy is generally toxic and unsatisfactory. It is of vital importance to set prompt diagnostic method along with identification of the parasite in order to select the suitable treatment and to design the most convenient control measures. Recently, the advances in molecular biology have made it possible to characterize Leishmania species by different methods. The random amplified polymorphic DNA technique is a simple method to detect the genetic polymorphic DNA. OBJECTIVE: to standardize the random amplified polymorphic DNA technique for its use in New World Leishmania species typing. METHODS: by using 5 pmol primer concentration, 75 ng of template DNA, 2 mM of magnesium chloride and 2 U of polymerase DNA Taq in 25µL reaction, two reproducible amplification patters were obtained. The optimized random amplified polymorphic DNA technique served to determine the genetic differences among ten reference strains of Leishmania, with 6 sets of randomly designed conventional primers. The UP GMA method-based grouping strategy determined the phylogenetic relation among the studied species. RESULTS: OPA primers -3, 4 and 8 allowed distinguishing the ten reference strains of Leishmania under study. Two well defined genetic groups including species of Leishmania and Viannia subgenres were obtained; these 2 subgenres showed genetic differences. CONCLUSIONS: in this way, our laboratory has the optimized random amplified polymorphic DNA for the identification of Leishmania species.

INTRODUCCIÓN: la leishmaniosis ha sido clasificada por la Organización Mundial de la Salud como una de las enfermedades tropicales más importantes. El control de esta parasitosis es muy difícil, porque no existen vacunas y el tratamiento es tóxico e insatisfactorio. Es de crucial importancia establecer un método de diagnóstico oportuno junto a la identificación del parásito, lo cual incide en la selección del tratamiento adecuado y en el diseño de las medidas de control apropiadas. Recientemente, los avances en biología molecular han permitido la caracterización de especies de Leishmania por diferentes métodos. La técnica de ADN polimórfico amplificado al azar es una técnica simple para detectar el polimorfismo genético del ADN. OBJETIVO: estandarizar la técnica de ADN polimórfico amplificado al azar para su utilización en la tipificación de especies de Leishmania del Nuevo Mundo. MÉTODOS: empleando una concentración de cebador de 5 pmol, 75 ng de ADN molde, 2 mM de cloruro de magnesio y 2 U de Taq ADN polimerasa en 25 mL de reacción, se obtuvieron patrones de amplificación reproducibles. La técnica optimizada de ADN polimórfico amplificado al azar se empleó para determinar las diferencias genéticas entre 10 cepas de referencia de Leishmania, con la utilización de 6 juegos de cebadores comerciales diseñados al azar. La relación filogenética entre las especies estudiadas se determinó utilizando la estrategia de agrupaciones mediante el método de UPGMA. RESULTADOS: los cebadores OPA 3, 4 y 8 permitieron diferenciar las 10 cepas de referencia de Leishmania estudiadas. Se obtuvieron 2 grupos genéticos bien definidos donde se agrupan las especies del subgénero Leishmania y Viannia, respectivamente; los 2 subgéneros mostraron diferencias genéticas. CONCLUSIONES: de esta forma se cuenta en el laboratorio con la técnica del ADN polimórfico amplificado al azar optimizada para la identificación de especies de Leishmania.

The infective capacity of Leishmania amazonensis promastigotes was evaluated after they were treated with a series of 10 thiadiazine derivatives. The parasites were incubated for 24 hours with 1 or 0,1 mg/ml of each compound and then, peritoneal macrophages from BALB/c mice were infected in cultures. All the compounds managed to reduce the infective capacity of parasites by more than 50%. T10 product exhibited the highest effect since it reduced infection by 92,8%.

Se evaluó la capacidad infectiva de promastigotes de Leishmania amazonensis al ser tratados con una serie de 10 derivados de la tiadiazina. Los parásitos fueron incubados durante 24 h con 1 o 0,1 mg/mL de cada compuesto y posteriormente, se infectaron macrófagos peritoneales de ratones BALB/c en cultivos. Todos los compuestos causaron una reducción de la capacidad infectiva de los parásitos mayor que 50 %. El producto T1O fue el que causó un mayor efecto, disminuyendo la infección en 92,8 % de infección.

The antiprotozoan activity of the essential oil extracted from Artemisa abrotanum, Chenopodium ambrosioides, Pinus caribaea, Piper aduncum and Piper auritum, was evaluated. The evaluated oils did not show activity against L. amozonensis; however, the oil extracted from C. ambrosoides showed a promising activity against Trichomonas vaginalis with a minimum inhibitory concentration of 25 mg/mL.

Se evaluó la actividad antiprotozoaria del aceite esencial extraído de Artemisia abrotanum, Chenopodium ambrosioides, Pinus caribaea, Piper aduncum y Piper auritum. Los aceites evaluados no mostraron actividad contra L. amazonensis; sin embargo, frente a Trichomonas vaginalis el aceite extraído de C. ambrosioides mostró una actividad promisoria con una concentración mínima inhibitoria de 25 mg/mL.

A genomic library of Leishaminia amazonensis was built through a pcDNA3 vector, with expression promoter in eukaryot cells, to contribute to the application of immunization technology with nucleic acids in leishmaniasis. To show the expression genomic library in the muscles of mice immunized with it, the indirect immunofluoresce technique was used. A mix of sera with high antileishmania titers from an area where L.braziliensis infection is predominant was used as primary antibody. A library of 80% recombinant clones was obtained. Antigen determinant expression was confirmed in immunized BALB/c mice´s muscles, according to the results of immunofluorescence testing.

Se construyó una biblioteca genómica de Leishmania amazonensis mediante el vector pcDNA3, con promotor de expresión en células eucariotas, con el objetivo de contribuir a la aplicación de la tecnología de inmunización con ácidos nucleicos en la leishmaniosis. Para demostrar la expresión de la genoteca en el músculo de ratones inmunizados con esta, se realizó la técnica de inmunofluorescencia indirecta. Como anticuerpo primario se utilizó una mezcla de sueros con alto título antileishmania, de una zona donde predomina la infección con L. braziliensis. Se obtuvo una biblioteca con 80 % de clones recombinantes. Se demostró la expresión de determinantes antigénicos en el músculo de ratones BALB/c inmunizados, según resultados de la inmunofluorescencia.

An expression genomic library of Trypanosoma cruzi was built by using plasmid pc DNA3 as a vector. This library served to immunize by intramuscular administration BALB/c inbred mice. A positive control group to which T.cruzi soluble antigens were administered and other group which was given the same plasmid used for the building of the genomic library were included in this study; another group was not immunized. Blood was extracted from the retrorbital plexus of all the mice two weeks after the third vaccination so as to study the specific antibody response to soluble parasite anigens through the Western Blot technique. The antibody response was shown in animals immunized with the expression genomic library and with soluble parasite antigens.

Se construyó una biblioteca genómica de expresión de Trypanosoma cruzi con la utilización como vector el plásmido pcDNA3, con la cual se inmunizaron ratones de la línea isogénica BALB/c por vía intramuscular. Se empleó un grupo control positivo al que se le administraron antígenos solubles de T. cruzi y otro grupo que recibió el plásmido utilizado para la construcción de la biblioteca genómica; un grupo no recibió inmunización. A todos los animales se les extrajo sangre del plexo retrorbital 2 semanas posteriores a la tercera inmunización, para estudiar la respuesta de anticuerpos específicos contra los antígenos solubles del parásito mediante la técnica de western blot. Se obtuvo una respuesta de anticuerpos en los animales inmunizados con la biblioteca genómica de expresión y con antígenos solubles del parásito.

An immunoenzymatic system on solid phase for the detection of IgG antibodies in serum from choronic Chagasic patients was standardized. A protease from Trypanosoma cruzi (GP57/51KDa) was used as an antigen. The sensitivity, specificity and predictive values of the procedure were calculated taking into account the results obtained from conventional serology (CS), indirect immunofluorescence (IIF), indirect hemagglutination (IHA) and complement-mediated lysis test (CML) for the detection of anti-Trypanosoma cruzi antibodies in serum. Except one, the positive samples obtained by those techniques were also positive by our method. These resultas show that GP 57/51 is useful in the serodiagnosis of Chagas disease.

Se normalizó un sistema inmunoenzimático en fase sólida para la detección de anticuerpos IgG en suero de pacientes chagásicos crónicos, se utilizó como antígeno una proteasa de Trypanosoma cruzi (GP57/51kDa). Para el cálculo de sensibilidad, especificidad y valores predictivos del procedimiento, se tomaron como referencias los resultados obtenidos por serología convencional (SC), inmunofluorescencia indirecta (IFI), hemaglutinación indirecta (HAI) y lisis mediada por complemento (LMC) para la detección de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi en el suero. Excepto 1, las muestras positivas por estas técnicas también lo resultaron por nuestro método. Estos resultados apoyan la utilización de GP 57/51 en el serodiagnóstico de la enfermedad de Chagas.

A study of Plasmodium vinckei peterri sporogony was performed by experimental infection of Anopheles stephensi with gametocytes from infected mice. The study includes the description of the ookinete, complete evolution of oocysts and their final transformation to sporozoites. These were later used for intravenous infection of new mice, in order to study the exoerythrocytic schizogony. The morphology of exoerythrocytic schizonts was similar to that of other species of the same group. The minimal duration of the hepatic cycle was found to be of 61 hours. These data, along with other related to the hematic cycle characteristics, help to complete the information on the species, which can be recommended as a model for the study of human malaria.

Por medio de la infección experimental de Anopheles stephensi, a partir de ratones portadores de gametocitos de Plasmodium vinckei petteri, se realizó el estudio morfológico de la esporogonia, que comprende: la descripción del ooquineto, la evolución completa de los ooquistes y su transformación final en esporozoitos. Estos fueron empleados más tarde para infectar por via intravenosa nuevos ratones, a los que se realizó biopsias sucesivas, para el estudio de los esquizontes exoeritrocíticos, cuya morfología no difere de la de otras especies del grupo. Se determinó la duración mínima del ciclo hepático, que resultó ser de 61 horas. Estos datos, junto a otros que refieren las características del ciclo hemático, ayudan a completar la información que se tiene sobre la especie, que la hacen recomendable para su utilización como modelo experimental en el estudio de la malaria humana.